E-człowiek

Zakończenie Human Genome Project w 2003 r. rozpoczęło nową epokę szybkich, dokładnych i przy tym coraz mniej kosztownych technologii analiz genomu. Przełomem badań genetycznych stało się wdrożenie metod sekwencjonowania, zwłaszcza sekwencjonowania następnej generacji (NGS). Jest to proces, który pozwala jednak uchwycić podstawę istnienia wszystkich żywych organizmów. Początkowo dekodowanie genomu było „zabawą” dla wybranych, a dziś laboratoria badawcze mogąu zamówić tę usługę. Co roku odkrywanie tajemnic informacji genetycznej, transkryptomicznej i epigenomicznej staje się coraz łatwiejsze.

Od dziesięcioleci znana jest metoda odczytywania kolejności par nukleotydowych w cząsteczce DNA, czyli sekwencjonowanie. Świat usłyszał po raz pierwszy o użyciu tej  technologii gdy Fred Sanger w 1977 r. zsekwencjonował cały genom faga wirusa ФX174. Wprowadzenie nowo opracowanej metody zapoczątkowało nową erę badań genetycznych. Jest ona obecnie postrzegana jako technologia „sekwencjonowania pierwszej generacji”.  

Metoda ta oparta jest na zakończeniu łańcucha DNA odpowiednim markerem: dideoksynukleotydem (ddNTP). Jest to typ trifosforanów deoksynukleozydów (dNTP), które zamiast grupy hydroksylowej 3′, posiadają atom wodoru. W warunkach PCR taka cząsteczka dołączana jest do budowanego łańcucha. Z powodu braku grupy hydroksylowej blokowana  jest możliwość powiększenia molekuły DNA. W trakcie przeprowadzenia sekwencjonowania metodą Sangera należy dodać startery do próbki z badanym materiałem biologicznym. A następnie należy podzielić ją na 4 równe części, po każdej do osobnej reakcji PCR. Do próbek dodawana jest mieszanina dNTP oraz osobno, jeden z czterech nukleotydów ddNTP (A, T, G i C). Ze względu na właściwości ddNTP, w każdym produkcie reakcji powstają w losowy sposób cząsteczki o różnej długości. Na przykład mamy DNA o następującej kolejności nukleotydów: AGCTATCGT. W każdej reakcji PCR pojawią następne fragmenty: 

ddATP: A, AGCTA 

ddCTP: AGC, AGCTATC 

ddTTP: AGCT, AGCTAT, AGCTATCGT 

ddGTP: AG, AGCTATCG 

W celu zanalizowania tych fragmentów, na jednym żelu umieszcza się produkty 4 reakcji, z których każda posiada osobny tor. Ostatecznie widoczne jest, że każdy prążek na żelu znajduje się na innej wysokości (Rys. 1). W zależności od toru można rozpoznać jaki jest ostatni nukleotyd fragmentu oraz podać kolejność produktów DNA od najmniejszego do największego.

Rys. 1. Przykład żelu wykorzystywanego przy sekwencjonowaniu DNA metodą Sangera 

Z czasem do technologii zostały wprowadzone nowe możliwości. Stworzono urządzenie do sekwencjonowania. Działało ono na zasadzie elektroforezy kapilarnej, a zamiast odczynników radioaktywnych, stosuje fluorescencję o innym kolorze dla każdego z nukleotydów. To dało możliwość wykorzystywania jednej próbki i jednej elektroforezy do całego procesu oraz sprawiło, że analiza stała się bardziej wydajną i dokładną. 

Pierwsze z takich urządzeń, AB370 (od ang. Applied Biosystems), mogło skanować 96 nukleotydów jednocześnie oraz molekuły DNA o długości do 600 par zasad. W taki sposób w ciągu jednego dnia można było uzyskać odczyt 500 tys. par zasad.

Na podstawie wyżej opisanej technologii naukowcom udało się stworzyć nową metodę – sekwencjonowanie następnej generacji. Innowacyjne rozwiązanie pozwala wykonywać badania DNA na ogromną skalę. Zwiększa ona ilość badanego DNA oraz odczytów. Odpowiednio duża liczba wyników pozwala na zbadanie genomów w ramach jednego sekwencjonowania. Udało się to osiągnąć dzięki zwielokrotnieniu równoległych procesów odczytu, poprzez jednoczesną detekcję tysięcy lub milionów sekwencji. Takie podejście pozwoliło istotnie zmniejszyć koszt badania pojedynczych próbek oraz rozszerzyło funkcjonalność w zakresie badań genetycznych. Zostały wdrożone innowacyjne opcje, takie jak: sekwencjonowanie genomu, profilowanie transkryptomu (RNA-Seq), interakcja DNA-białko (ChIP-sekwencjonowanie), charakteryzacja epigenomu, metagenomika i inne. 

NGS nie bez oddźwięku pojawiło się na rynku komercyjnym, a różne firmy wciąż prześcigają się w innowacjach. Najbardziej znanymi firmami, które zaproponowały swoje rozwiązania w tym zakresie są: Ion torrent, Nanopore i Illumina.

Wszystkie enzymatyczne procesy oraz sczytywanie odbywają się w tak zwanej flow cell. Jest to komora przepływowa, która zawiera miliony nanokomórek. W każdej z nich znajdują się fragmenty DNA, odpowiadające odrębnemu indeksowi. Te ostatnie podczas przygotowania bibliotek dołączane są do fragmentowanego DNA (do 300 par zasad nukleotydowych) w odrębnych próbkach. To pozwala analizować osobno, a zarazem jednocześnie, aż do 96 różnych próbek materiału genetycznego. 

Ogólne działanie systemu polega na tym, że przy przeprowadzeniu sekwencjonowania denaturowane (jednołańcuchowe) DNA przechodzi przez flow cel i zatrzymuje się na odpowiednim klastrze. Po tym ma miejsce amplifikacja. Odbywa się ona w taki sposób, że nukleotydy są przyłączane pojedynczo. Generowany jest krótki, laserowy impuls, który pobudza fluorescencję charakterystyczną dla nukleotydu. Następnie dochodzi do powtarzania się cykli. Wyniki dostarczone są w formie plików komputerowych - jako zdjęcia o wysokiej rozdzielczości oraz w rozszerzeniu fastq. Fastq zawiera nie tylko informacje o kolejności DNA, ale również o dokładności przeprowadzonej analizy. Wygenerowane dane genetyczne mogą osiągać nawet 600 Gb w jednym sekwencjonowaniu. 

Technologia Ion torrent wykorzystuje mikrokomórki, które zawierają badane DNA. Sekwencjonowanie odbywa się również za pomocą amplifikacji. Do każdej mikrokomórki, po kolei, są dodawane nukleotydy jednego typu. Kiedy nukleotyd jest przyłączany, wywołuje uwolnienie jonów wodoru, które powodują działanie czujnika i zapisywanie wyniku. Gdy dołączone zostaje kilka jednakowych nukleotydów w jednym cyklu, sygnał jest proporcjonalnie silniejszy.

Metoda ta została określona jako sekwencjonowanie trzeciej generacji. Wykorzystuje ono specjalną błonę, która rozdziela flow cell na dwie reakcyjne części, mające różny potencjał elektryczny. Błona ma setki, a nawet tysiące nanoporów, stworzonych z białek albo z twardej struktury. Przechodzą przez nie jony, wyrównując różnicę potencjałów. DNA jest naładowany ujemnie, dlatego łańcuchowo przechodzi przez por na drugą stronę, wypełniając kanał, zmieniając tym samym przepływ jonów. Różne typy nukleotydów w inny sposób wpływają na transport jonów, dzięki czemu można identyfikować sekwencję całego łańcucha. Dzięki tej technologii w ramach jednej analizy można zbadać fragment DNA o długości nawet do 40 tys. par zasad. 

Obecnie ma miejsce szybki rozwój technologii związanych z badaniem genów, białek i innych struktur molekularnych żywych organizmów. Opracowywane są przenośne, szybkie, dokładne i uniwersalne metody badania obiektów biologicznych. Pojawieniu się wysokowydajnych technologii sekwencjonowania DNA towarzyszy rozwój oprogramowania i tworzenie algorytmów z otwartym kodem źródłowym (ang. Open Source). Nowe technologie matematyczne i informatyczne pozwalają genomice szybciej się rozwijać i wykorzystywać bardziej złożone algorytmy (na przykład sieci neuronowe).

Ilość informacji otrzymanej przez sekwenatory znacznie wyprzedziła możliwości analizy matematycznej uzyskanych wyników. Ale nawet pomimo tego, nauki biomedyczne nieprzerwanie biorą udział w rewolucji genomowej, gdyż codziennie pojawiają się nowe dane, a firmy biotechnologiczne oferują coraz więcej innowacyjnych rozwiązań, które znacznie ułatwiają diagnozowanie chorób, zbliżając świat do stosowania medycyny spersonalizowanej.