Co to jest PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy?
PCR
Co to jest PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy?

PCR jest techniką wykorzystywaną w laboratoriach do stworzenia miliona kopii dowolnego fragmentu DNA. Technika ta została opracowana przez Mullisa i współpracowników z firmy Cetus w Kalifornii w roku 1983.

NK
Autor: Natalia Koj 27 kwi 2021 / / Edycja: Izabela Kołodziejczyk
Kategoria: biotechnologia
Tagi:
pcr
polimeraza

Technika PCR – zasada działania

Technika łańcuchowej reakcji polimerazy PCR (ang. Polimerase Chain Reaction) opiera się na procesie replikacji nici DNA [link do artykułu o DNA] Do przeprowadzenia reakcji PCR potrzeba kilku składników. Są to: 

matrycowy DNA, który posiada region do skopiowania, jest to np. gen; 

startery, które wiążą się komplementarnie na obu końcach interesującego nas genu; 

wolne nukleotydy, wykorzystywane do budowy nowych nici DNA; 

termostabilna polimeraza DNA – enzym, działający przez dobudowywanie nukleotydów do matrycowego DNA; 

bufor, który zapewnia odpowiednie środowisko reakcji (pH oraz siłę jonową); 

jony magnezu (Mg2+) – wpływają na odpowiedną aktywność polimerazy DNA. 

 

Ważną informacją, jaka jest potrzebna do skopiowania pożądanego fragmentu DNA, jest znajomość sekwencji dwóch krótkich regionów nukleotydów obecnych na końcach nici. Dzięki tej wiedzy możliwe jest zsyntetyzowanie dwóch starterów, które odpowiadają krótkim sekwencjom matrycy, okalającym wybrany fragment DNA. Przeprowadzenie reakcji PCR, oprócz odpowiednio dobranego składu mieszaniny oraz starterów wymaga zapewnienia odpowiednich warunków temperaturowych. 

Klasycznie, reakcja PCR przebiega w trzech etapach: denaturacji, przyłączenia starterów i wydłużania sekwencji, które powtarzają się cyklicznie. Każdy z nich wymaga odpowiednio dobranej temperatury oraz czasu inkubacji. W pierwszym stadium dochodzi do denaturacji, czyli separacji dwóch łańcuchów DNA. Etap ten zachodzi w temperaturze 94˚C lub większej i trwa od 15 sekund do 2 minut. Dochodzi wówczas do rozerwania wiązań wodorowych pomiędzy zasadami azotowymi, znajdującymi się między dwoma łańcuchami matrycy DNA.  W ten sposób powstają dwie osobne nici DNA, służące jako matryca do budowania nowych nici. W drugim etapie temperatura obniżana jest do około 40 – 60˚C. Dzięki temu startery przyłączają się do odpowiedniego miejsca na jednoniciowej matrycy DNA. Startery mają długość około 20-30 nukleotydów i są komplementarne do części sekwencji na obu końcach nici DNA. W trzecim, ostatnim etapie, temperatura podnoszona jest do około 70 - 74˚C i wtedy to polimeraza dodaje nukleotydy na końcu przyłączonych starterów. Ostatni krok trwa około 1-2 minuty. Następnie kolejny cykl rozpoczyna się poprzez powrót do temperatury ok. 94˚C i ponownie dochodzi do denaturacji. Podczas pierwszego cyku z każdego jednoniciowego DNA powstaje kolejny fragment, wiec liczba fragmentów ulega podwojeniu, w następnym natomiast ilość DNA jest czterokrotnie większa, itd. Po 30 cyklach otrzymujemy ponad miliard kopii DNA. Stanowi to podstawę analizy amplifikowanego produktu. Analiza może dotyczyć np. wielkości, ilości czy sekwencji powstałego produktu reakcji.

PCR – odkrycie biotechnologii

Technika PCR została stworzona przez amerykańskiego biochemika Kary B. Mullisa i jego współpracowników w 1983 r. Za swoje osiągniecie Mullis został nagrodzony nagrodą Nobla w dziedzinie chemii w 1993 r. Stworzona technika umożliwia szybkie i wielokrotne powielenie dowolnego fragmentu DNA o długości od kilku do kilkuset tysięcy nukleotydów. Przed wprowadzeniem metody PCR wykorzystywano inne techniki tworzenia kopii DNA. Opierają się one na wklonowaniu fragmentów DNA do wektora. Następnie wektor wprowadzany jest do żywych komórek gdzie może się powielać. Metoda ta wymaga dni lub tygodni pracy. Natomiast wykorzystanie reakcji PCR pozwala na wytworzenie miliarda kopii DNA w zaledwie kilka godzin.  

Początki stosowania reakcji PCR nie były jednak łatwe ponieważ enzym wykorzystywany do reakcji PCR (polimeraza) był niszczony w każdym termicznym cyklu przez wysoką temperaturę, która jest niezbędna na początku w czasie replikacji. Problem ten został rozwiązany w 1987 r. po odkryciu termostabilnej polimerazy DNA, nazwanej polimerazą Taq. Została ona wyizolowana z bakterii Termus aquaticus zamieszkujących gorące źródła. Jest ona odporna na ciepło i wystarczy ją dodać do mieszaniny na początku reakcji. Dzięki polimerazie Taq można było łatwo zautomatyzować reakcje PCR. Uzyskano to poprzez wynalezienie termocyklera, czyli  urządzenia wyposażonego w blok grzejny, zapewniający szybką i precyzyjną zmianę temperatury na poszczególnych etapach reakcji. 

Zastosowanie reakcji PCR

Technika PCR jest wykorzystywana do stworzenia miliona kopii pożądanego fragmentu DNA. Jest to niezastąpione narzędzie wykorzystywane zarówno w nowoczesnej biologii molekularnej, w badaniach naukowych, jak i w diagnostyce medycznej.  

Technika PCR znajduje zastosowanie m.in w: 

diagnostyce mikrobiologicznej - przyczynia się do szybkiego wykrywania patogenów, gdy ich hodowla in vitro jest trudna i długotrwała. Technika PCR umożliwia identyfikację określonych gatunków drobnoustrojów. Mogą być to np. bakterie Escherichia coli w wodzie.  

genetyce sądowej - wykorzystywana jest ona w celu identyfikacji przestępców czy w testach na ojcostwo. Nawet śladowe ilości materiału genetycznego po namnożeniu mogą być źródłem niepowtarzalnego osobniczo profilu DNA. 

diagnostyce chorób o podłożu genetycznym – pozwala to na analizę materiału genetycznego pod względem obecności mutacji odpowiedzialnej za rozwój choroby oraz symptomów z nią związanych. Wykorzystuje się ją do m.in. diagnostyki dystrofii mięśniowej, anemii sierpowatej, mukowiscydozy, czy fenyloketonurii. 

diagnostyce nietolerancji pokarmowych – pozwala wykryć nietolerancje pokarmowe o podłożu genetycznym. Są to przede wszystkim: nietolerancja laktozy, celiakia, czyli nietolerancja na gluten, a  także fruktozemia, czyli nietolerancja na fruktozę.  

diagnostyce predyspozycji do chorób – pomaga w wykrywaniu mutacji zwiększającej ryzyko rozwoju schorzenia w przyszłości, np. nowotoworów. Może dotyczyć wykrywania zmian w genach, takich jak BRCA1 i BRCA2, które zwiększają ryzyko zachorowania na raka piersi i jajnika. 

diagnostyce i monitorowaniu zakażeń wirusowych – możliwe jest potwierdzenie obecności materiału genetycznego wirusa w organizmie. Technika pozwala na wykrycie wirusowego DNA znacznie wcześniej niż wirus osiągnie stadium zdolności do inicjacji odpowiedzi chorobowej. Dodatkowo można określić dokładną liczbę kopii wirusa w określonej objętości krwi, a następnie po leczeniu powtórzyć badanie w celu oceny skuteczności terapii. 

Słabe i mocne strony PCR

Technika PCR posiada prostą procedurę, co dodatkowo wzmocniło jej istotność, a także poszerzyło wachlarz jej zastosowań w badaniach naukowych.  

Należy jednak pamiętać o jej ograniczeniach. Jednym z nich jest potrzeba znajomości sekwencji części DNA na końcach fragmentów do amplifikacji. Informacja ta potrzebna jest do syntezy starterów, które będą przyłączać się w tych pozycjach. Oznacza to, że techniki tej nie można wykorzystać do amplifikacji fragmentów genów lub innych fragmentów genomów, które wcześniej nie były badane. Kolejnym ograniczeniem jest długość DNA, jaki może ulegać skopiowaniu. Najbardziej optymalną długością fragmentu do amplifikacji jest fragment DNA liczący 5000 par zasad. Dłuższe odcinki, około 40000 par zasad możliwe są do kopiowania, ale z zastosowaniem modyfikacji techniki standardowej. Większych fragmentów, czyli takich powyżej 100000 par zasad, które są potrzebne do sekwencjonowania genomów nie można amplifikować za pomocą PCR.  

Z drugiej strony technika PCR ma zalety. Pierwszą z nich jest łatwość otrzymania produktu z różnych próbek biologicznych, np. z krwi, włosów, śliny, włosów, bądź spermy. Dodatkowo reakcja PCR działa już przy minimalnej ilości wyjściowego DNA. Można ją stosować posiadając jedynie śladowe ilości materiału. Technika ta jest stosunkowo szybka i prosta.